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檢驗原理：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。操作步驟： 1. 涂片經火焰固定，加（結晶紫溶液）溶液A染1分鐘，用清水沖去染液。 2.加（碘液）溶液B染1分鐘，水洗。 3.加（95%乙醇）溶液C，不時搖動玻片約10-30秒，至無紫色脫落為止，水洗。 4.加（沙黃復染液）溶液D，染1分鐘，水洗。 5.干后油鏡鏡檢。陽性菌呈紫色、陰性菌呈淡紅色。

892022-03-30 青島高科技工業園海博生物技術有限公司

甘油凍存保存法——液體菌種保存管

為什么利用甘油來進行菌種保存呢？甘油作為一種保護劑，可以降低水的凝固點，減少冰晶形成，從而防止冰晶對細胞造成損傷。方法一：直接挑取待測菌至液體菌種保存管首先觀察平板上的菌落大小，若單個菌落在2-3mm，則挑取2-3個單個菌落，若單個菌落較小，可挑取3個以上單個菌落，以保證菌種保存液濃度不小于3-4麥氏比濁度。將挑取的菌苔接種至海博生物液體菌種保存管中，充分振蕩，然后蓋上蓋子，上下顛倒，使菌種與保存液充分融合，之后放入超低溫冰箱進行保存。方法二：吸取菌懸液接種至液體菌種保存管中用移液槍吸取200ul菌懸液，接種至海博生物液體菌種保存管中，用移液槍反復吹打，使其與保存液充分融合，操作完成后放入超低溫冰箱進行保存。保存溫度與保存時間的關系：保存溫度越低效果越好，-20℃一般可保存一年以上，-70℃一般可保存兩年以上。注意事項：反復凍融易導致菌株死亡，融化后的保存管不可再進行冷凍保存。

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改良克氏雙糖鐵實驗

改良克氏雙糖鐵培養基中含有少量的葡萄糖和大量的山梨醇，常用于小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢驗。首先，用接種針挑取試驗菌苔，“之”字劃線接種于改良克氏雙糖鐵培養基斜面處，之后底層穿刺，穿刺約培養基1/2深度。本試驗以鼠傷寒沙門氏菌、普通變形桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、福氏志賀氏菌為例進行試驗。之后放置于25℃需氧培養24小時。實驗現象及原理解釋：培養結束后取出試管觀察，發現接種鼠傷寒沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌的試管斜面及底層均為黃色，這是因為這兩種細菌能發酵葡萄糖及山梨醇，產生大量酸，pH下降培養基變黃；普通變形桿菌和福氏志賀氏菌斜面紅色底層黃色是由于細菌僅能發酵葡萄糖，產生少量酸，斜面處的酸受空氣氧化成堿性物質使pH較高顯紅色，底層酸不被氧化顯黃色；接種鼠傷寒沙門氏菌和普通變形桿菌的試管有氣泡產生且變黑，是由于產硫化氫細菌可還原硫代硫酸鈉、硫酸亞鐵生成硫化氫，與培養基中亞鐵離子反應生成黑色的硫化亞鐵。

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淀粉水解實驗——可溶性淀粉瓊脂淀粉水解培養基盧戈氏碘液

操作步驟： 1.用接種環挑取待測菌菌懸液或直接挑取菌落，劃線接種于可溶性淀粉瓊脂平板上。 2.同時接種陰性和陽性對照菌株，陽性菌株可用枯草芽孢桿菌，陰性菌株可用大腸埃希氏菌。 3.之后放置于36℃培養72-96小時。 4.培養結束后取出平板，滴加2-3滴盧戈氏碘液，輕輕晃動平板使菌液均勻分布，觀察顏色變化。結果觀察：接種蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌的平板，遇碘菌落周圍不變藍，為陽性反應；接種大腸埃希氏菌的平板，遇碘菌落周圍變藍，為陰性反應。

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蛋白質毒素結晶試驗——0.5%堿性復紅溶液

什么是蛋白質毒素結晶試驗：在GB4789.14標準中，在進行蠟樣芽胞桿菌鑒定時蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽孢桿菌生化反應相同，但蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時，會在芽孢旁形成一顆菱形、方形或不規則形的堿溶性蛋白質晶體，稱為伴孢晶體，該晶體易被堿性染料著色，因此常用0.5%堿性復紅染料進行染色觀察。而蠟樣芽胞桿菌和其他芽孢桿菌不產生伴孢晶體。這個染色實驗就是蛋白質毒素結晶試驗。操作步驟：培養芽孢：將待測菌株接種至硫酸錳營養瓊脂平板，30?1℃培養24?2h，并于室溫放置3-4天。若芽孢產生不豐富，可在室溫繼續放置2-3天后觀察。原理：芽孢桿菌在營養條件缺乏時，開始形成芽孢，因此在進行細菌產芽孢相關試驗時，通常需進行5-7天的放置或培養，待培養基內營養耗盡，可獲得更豐富的芽孢。制片染色：挑取培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經自然干燥，微火固定后，加甲醇作用 30 s 后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿 0.5%堿性復紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰)持續 1 min～2 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色 30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。（注：在菌苔生長密集的地方營養消耗更快，更容易產生芽孢，因此挑取密集生長處的菌苔制片易觀察到更多芽孢）

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單增李斯特氏菌溶血試驗——血平皿~1

實驗操作： 1、向上用力掀開塑料瓶蓋。將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個~25個小格。 2、抬起鋁塑環，沿著鋁塑蓋上的刻痕，水平方向用力拉動拉環。挑取純培養的單個可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌)，穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂。 3、36 ℃?1 ℃培養24h~48h。結果觀察：培養結束后于明亮處觀察：單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生弱的透明溶血圈；英諾克李斯特氏菌無溶血圈；伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域。將待測菌的溶血現象與對照菌對比，再結合其他生化鑒定實驗即可判斷待測菌是否為單增李斯特氏菌。

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帶鐵絲采樣袋的使用方法——無菌取樣袋（帶鐵絲）~1

產品介紹：帶鐵絲的無菌采樣袋是一種安全、無污染的采樣袋容器，主要用于：環境取樣、生物醫學及制藥學研究、食品行業品質檢測（QA/QC)應用，以及臨床用藥和獸醫用藥等領域。使用方法： 1.先撕開取樣袋上方的虛線封口。 2.拽住袋體兩側的短耳向外拉，開啟取樣袋口。 3.將樣本置于取樣袋中，本品袋子開口很大，樣品置入非常方便。 4.抓住兩邊的長耳，使袋體兩內表面靠近。 5.將取樣袋繞著拉耳鐵絲所在的直線旋轉3-4圈。 6.將兩個長耳彎折在取樣帶上，并做好標記即可。整個采樣過程方便快捷，且不會污染袋體內部也不會漏液。注意事項：如果樣品量較多或者樣品特殊，不方便甩起來，也可直接將封口部分繞鐵絲旋轉、彎折進行封口。

1262022-03-30 青島高科技工業園海博生物技術有限公司

苯丙氨酸脫氨酶實驗——苯丙氨酸脫氨酶

實驗步驟： 1.首先取一支苯丙氨酸脫羧酶生化管，在易折點處掰開安瓿瓶，備用。 2.用接種針挑取待測菌落，劃線接種于苯丙氨酸脫羧酶生化管中。 3.用封口膜封口，放置于36℃需氧培養18-24小時。 4.培養結束后，向生化管斜面上滴加2-3滴苯丙氨酸指示劑。結果判定：陽性菌：如普通變形桿菌，斜面會變成綠色。陰性菌：如大腸桿菌，則變色。實驗原理：有些細菌(如:普通變形桿菌)可以產生苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，而苯丙酮酸能使三氯化鐵(苯丙氨酸指示劑)變綠色。

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